Milo Ventigmilia wuchs in Anaheim auf und begann sich sehr früh für Schauspielerei zu interessieren. Bereits im Alter von acht Jahren sagte er voraus, in 20 Jahren einen Academy Award zu gewinnen.
Er erhielt ein Stipendium am American Conservatory of Theatre in San Francisco und ging danach an die University of California Los Angeles und erhielt bereits in seinem ersten Jahr eine Gastrolle in The Fresh Prince of Bel-Air.
Es folgten weitere Gastauftritte in den TV Serien Sabrina, the Teenage Witch, CSI: Crime Scene Investigation, Boston Public und Law & Order: Special Victims Unit.
Zwischen 2001 und 2006 war er als Jess Marino, der Neffe von Luke und Rorys vorübergehender Freund, in Gilmore Girls zu sehen. Danach übernahm Ventigmilia eine Hauptrolle im kurzlebigen FOX-Drama The Bedford Diaries. 2006 spielt er Sylvester Stallones Sohn im sechsten Teil der „Rocky“-Filme, „Rocky Balboa“.
Die Rolle des Peter Petrelli in der Superhelden-Serie Heroes (2006- 2010) bedeutete für Milo Ventigmilia den großen Durchbruch als Schauspieler. 2012 wurde der Darsteller als Mafia-Anwalt Ned Stax in der Krimiserie Mob City gecastet. Die Serie wurde allerdings ziemlich schnell, nach nur einer Staffel, im Jahres 2013 beendet.
Ventimiglia zog weiter zur Crackle-Mysteryserie Chosen, wo er 2013-2014 die Hauptrolle des Ian Mitchell spielte. In Gotham war er 2015 in drei Episoden als Ogre zu sehen. Eine Serienhauptrolle übernimmt der Darsteller 2015 in The Whispers, das Jahr darauf bringt die nächste, und zwar in der Drama-Serie This Is Us. Die Rolle spielte er für sechs Jahre.
Milo Ventimiglia ist Vegetarier und großer Skateboard-Fan. Nachdem er bis Sommer 2006 dreieinhalb Jahre mit seiner Gilmore Girls-Kollegin Alexis Bledel liiert war, wurde seine Kollegin aus Heroes, Hayden Panettiere, von Dezember 2007 bis Februar 2009 seine Freundin. Der Schauspieler hat auf seinem Oberarm die Tätowierung eines Sterns. Die Tätowierung bezieht sich auf einen Text in Elvis Presleys Song Pocketful of Rainbows. Ventimiglia hat nie geheiratet oder hat Kinder. Seine Dating-Geschichte führt mehrere hochkarätige Co-Stars über die Jahre auf. Alexis Bledel aus Gilmore Girls und Hayden Panettiere von Heroes sind darunter.