Luke Macfarlane wird durch die Rolle des Scotty Wandell in der US-Serie Brothers & Sisters bekannt, des Ehemanns von Kevin Walker (Matthew Rhys). Daneben gehört Macfarlane zum Cast der Militärserie Over There. 2012 wird Macfarlane für eine Hauptrolle der kanadischen Comedyserie Satisfaction verpflichtet, die 2013 nach nur 13 Episoden eingestellt wird.
Es folgt eine wiederkehrende Rolle in The Night Shift und eine Hauptrolle in der Science-Fiction-Serie Killjoys.
In der historischen PBS-Miniserie Mercy Street spielt Macfarlane 2016 die Hauptrolle als Chaplain Hopkins. Anschließend ist er in mehreren Fernsehfilmen des Senders Hallmark zu sehen.