Anthony Mackie erlangte internationale Bekanntheit durch seine Rolle als Sam Wilson alias Falcon im Marvel Cinematic Universe und übernahm in der Serie The Falcon and the Winter Soldier schließlich den Schild von Captain America.
Anthony Mackie wurde in New Orleans geboren. Schon früh zeigte Anthony Interesse an der Schauspielerei und besuchte die New Orleans Center for Creative Arts (NOCCA). Nach seinem Abschluss setzte er seine Ausbildung an der North Carolina School of the Arts fort und schloss sie 1997 ab. Anschließend studierte er an der renommierten Juilliard School in New York City und gehörte dem Drama Division's Group 30 (1997-2001) an.
Sein Filmdebüt gab Anthony Mackie 2002 in dem Musikdrama „8 Mile“, in dem er die Rolle des Papa Doc spielte. 2004 übernahm er die Hauptrolle des Perry in „Brother to Brother“, einem Drama über einen jungen, homosexuellen Afroamerikaner. Für seine Darstellung erhielt er eine Nominierung für den Independent Spirit Award als Bester Hauptdarsteller. Im selben Jahr spielte er in Filmen wie „The Manchurian Candidate“ und „Million Dollar Baby“ mit.
In den folgenden Jahren festigte Mackie seinen Ruf als vielseitiger Schauspieler. 2006 spielte er in dem Drama „Half Nelson“ die Rolle des Frank, eines Lehrers, der mit persönlichen Problemen kämpft. 2008 war er in Kathryn Bigelows Kriegsdrama „The Hurt Locker“ als Sergeant JT Sanborn zu sehen. 2011 übernahm er die Rolle des Harry Mitchell in „The Adjustment Bureau“, einem Science-Fiction-Romanze-Thriller.
Im Jahre 2014 trat Anthony Mackie dem Marvel Cinematic Universe (MCU) bei und verkörperte Sam Wilson, auch bekannt als Falcon, in „Captain America: The Winter Soldier“. Seine Darstellung eines ehemaligen Pararescue-Soldaten, der zum Superhelden wird, fand großen Anklang bei den Fans des Franchises.
In den folgenden Jahren wiederholte er diese Rolle in Filmen wie „Avengers: Age of Ultron“ (2015), „Ant-Man“ (2015), „Captain America: Civil War“ (2016), „Avengers: Infinity War“ (2018) und „Avengers: Endgame“ (2019).
Im Jahr 2025 ist Anthony Mackie erstmals als neuer Captain America in dem Film „Captain America: Brave New World“ zu sehen. Dieser Film markiert einen bedeutenden Schritt in seiner Karriere, da er das ikonische Schild übernimmt.
Neben seinen Filmauftritten engagierte sich Mackie auch im Fernsehen. 2021 kehrte er als Sam Wilson in der Disney+-Serie The Falcon and the Winter Soldier (2021) zurück. Die Serie folgt Sam und Bucky Barnes aka Winter Soldier bei ihren Abenteuern nach den Ereignissen von „Avengers: Endgame“. Für seine Leistung in dieser Serie erhielt Mackie den MTV Movie & TV Award als Bester Held.
Im Jahre 2020 übernahm er die Hauptrolle des Takeshi Kovacs in der zweiten Staffel der US-Serie Altered Carbon. In dieser Sci-Fi-Serie spielt er einen ehemaligen Soldaten, dessen Bewusstsein in verschiedene Körper transferiert wird. 
Neben seinen Filmprojekten äußerte Mackie den Wunsch, auf der Londoner Theaterbühne aufzutreten. In einem Interview erklärte er, dass er gerne mit einem aufstrebenden Dramatiker zusammenarbeiten würde, um frische und aktuelle Geschichten zu präsentieren. 
Anthony Mackie heiratete 2014 seine Jugendliebe Sheletta Chapital, mit der er vier Kinder hat. Das Paar ließ sich jedoch 2018 scheiden. Neben seiner Schauspielkarriere eröffnete Mackie 2011 eine Bar namens NoBar in Brooklyn, New York, die jedoch 2015 geschlossen wurde.