Ihr Alter Ego als chaotisch-charmante Anwältin Ally McBeal wird Calista Flockhart wohl für den Rest ihres Lebens begleiten und doch schafft es die Schauspielerin, auch in Brothers & Sisters und Supergirl zu überzeugen.
Aufgewachsen ist Calista Flockhart im Bundesstaat New York, nachdem sie mit ihren Eltern von Iowa über Minnesota und später nach New Jersey umziehen musste. Nach ihrem Highschool-Abschluss machte sie an der Rutgers University in New Jersey ihren Bachelor in Schauspiel.
Obwohl Calista Flockhart den meisten als Fernseh- und Filmschauspielerin bekannt ist, trat sie bereits in vielen Theaterstücken und Boradway-Produktionen auf. Ihr Debüt auf dem Broadway feierte sie in dem Tennessee Williams-Stück „The Glass Menagerie“. Für diese Rolle erhielt sie den Theatre World Award und den the Clarence Derwent Best New Talent Award.
Ihre Rolle in der Komödie „The Birdcage“ mit Gene Hackman und Robin Williams verdankte sie ihrem Auftritt in dem Warren Leight Theaterstück „The Loop“. Auf der großen Leinwand war sie außerdem in der Film-Adaption des Shakespeare Stücks „A Midsummer Night's Dream“, „Things You Can Tell Just by Looking at Her“ und „The Last Shot“ zu sehen.
Der große Durchbruch gelang ihr 1997 in der FOX-Serie Ally McBeal. Die Rolle der Ally McBeal brachte ihr einen Golden Globe und einen People's Choice Award. Nominiert war sie unter anderem für den Screen Actors Guild Award, Emmy, TV Guide Award, American Comedy Award, sowie für einen weiteren People's Choice Award und mehrere Golden Globes.
Die von David E. Kelley kreierte Serie erreichte fünf Staffeln und endete im Jahr 2002.
2006 bis 2011 spielt sie die Hauptrolle der Kitty Walker in der ABC-Serie Brothers & Sisters. In Web Therapy war Flockhart 2014 zu Gast. In Full Circle sah man die Darstellerin 2015.
Im Jahr 2015 übernahm Calista Flockhart die Rolle der Cat Grant in der Serie Supergirl (2015-2021), einer einflussreichen Medienunternehmerin und Gründerin von CatCo Worldwide Media. Cat Grant wird als ehrgeizige und scharfsinnige Frau beschrieben, die ihre Karriere als Reporterin begann und ein globales Medienunternehmen aufbaute. In der ersten Staffel ist sie die Chefin der Hauptfigur Kara Danvers und fungiert als deren Mentorin, wobei sie oft direkt und fordernd auftritt. Nach der ersten Staffel zog sich die Figur aus der Serie zurück, da die Produktion von Los Angeles nach Vancouver verlegt wurde. In der zweiten Staffel trat Flockhart noch einmal in zwei Episoden als Gastdarstellerin auf. Insgesamt verkörperte sie Cat Grant in 26 Episoden der Serie.
Nach ihrem Engagement bei Supergirl zog sich Calista Flockhart weitgehend aus der Schauspielerei zurück und konzentrierte sich auf ihr Familienleben. Im Jahr 2024 kehrte sie für die Serie Feud: Capote vs. the Swans (2024) vor die Kamera zurück, in der sie die Rolle der Lee Radziwill übernahm. Im selben Jahr wirkte sie zudem als Synchronsprecherin an der Animationsserie Invincible (2025) mit. Flockhart ist seit 2010 mit dem Schauspieler Harrison Ford verheiratet und hat einen adoptierten Sohn. In einem Interview erklärte sie, dass sie die Entscheidung, sich aus dem Rampenlicht zurückzuziehen, nie bereut habe.