Jennifer Esposito hat bereits in zahlreichen Serien mitgewirkt. Ihren Durchbruch feiert die New Yorkerin 1997 als Stacey Paterno in Spin City, wo sie in zwei Staffeln als Hauptdarstellerin im Team des Bürgermeisters arbeitet.
Anschließend ist sie in einer wiederkehrenden Rolle in Judging Amy (2004-2005) zu sehen und hat eine der Hauptrollen in der kurzlebigen Dramedy Related (2005-2006) inne. Zu ihren weiteren Engagements zählen Rescue Me und eine Hauptrolle in der Comedyserie Samantha Who? (2007-2009).
2010 übernimmt Jennifer Esposito in der Serie Blue Bloods an der Seite von Tom Selleck und Donnie Wahlberg die Rolle von Detective Jackie Curatola. Im Oktober 2012 bittet sie den Sender CBS um reduzierte Arbeitszeiten aufgrund ihrer Zöliakie-Erkrankung. Dabei handelt es sich um eine chronische Erkrankung der Dünndarmschleimhaut, welche unter anderem häufig Durchfall, Erbrechen und Müdigkeit als Symptome zur Folge hat. Nach Ansicht des Networks ist Esposito nicht länger in der Lage, den Anforderungen ihrer Rolle gerecht zu werden, was zu ihrer unbefristeten Beurlaubung und schließlich zu ihrem Ausstieg führt.
In der französisch-amerikanischen Ko-Produktion Taxi Brooklyn erhält sie 2014 eine Hauptrolle. Nach nur einer Staffel wird die Serie beendet. 2015 ist Jennifer Esposito als Hauptfigur Calista Raines eine Staffel in der ABC-Serie Mistresses dabei.
Jennifer Esposito wirkt zudem regelmäßig in Filmen mit, darunter „I Still Know What You Did Last Summer“, Spike Lees „Summer of Sam“, „Taxi“ und „Crash“, wo sie Don Cheadles Freundin spielt.
In The Affair ist Esposito ab in einer wiederkehrenden Rolle als Noahs (Dominic West) Schwester Nina zu sehen. 2016 übernimmt sie als Special Agent Alexandra Quinn einen Platz im Stammcast der langlebigen Serie NCIS, wo sie abermals nur eine Staffel lang dabei ist. Im Thriller „Cigarette“ spielt die Darstellerin 2017 an der Seite von John Travolta.
Esposito ist von 2006 bis 2007 mit Bradley Cooper verheiratet. Zwei Jahre später plant sie, mit dem australischen Tennisspieler Mark Philippoussis vor den Traualtar zu treten. Die Verlobung der beiden wird schließlich gelöst.
Im Mai 2014 gibt die Schauspielerin die Verlobung mit ihrem Partner, dem britischen Model Louis Dowler, bekannt. Das Paar heiratet am 16. November 2014 in New York City. Im März 2016 wird bekannt, dass sie die Scheidung eingereicht hat.
Jennifer Esposito hat in New York eine glutenfreie Bäckerei eröffnet, Jennifer's Way. 2014 erscheint ihr Buch "Jennifer's Way", in dem sie ihren Kampf mit der Zöliakie-Erkrankung beschreibt.